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逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)必看重難點(diǎn)分享
點(diǎn)擊次數(shù):383 更新時(shí)間:2024-03-18

逆轉(zhuǎn)錄(reverse transcription,是以RNA為模板合成DNA的過程,合成的DNA稱為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄過程遺傳信息的流動(dòng)方向?yàn)?/span>RNADNA,與轉(zhuǎn)錄過程DNARNA的方向相反,故稱為逆轉(zhuǎn)錄。

一、實(shí)驗(yàn)原理要素:

酶促催化使RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA第一鏈。一條寡聚脫氧核苷酸引物先與RNA雜交,然后由RNA依賴的DNA聚合酶催化合成相應(yīng)互補(bǔ)的cDNA拷貝,后者能進(jìn)一步用于PCR擴(kuò)增。依據(jù)實(shí)驗(yàn)的不同目的,針對(duì)cDNA第一鏈合成的引物可根據(jù)特殊的靶基因設(shè)計(jì),或可用隨機(jī)引物與所有mRNA雜交。

實(shí)驗(yàn)要素:

逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)包括3大要素,分別是引物、逆轉(zhuǎn)錄酶和 RNA 模板:

1. 引物:

逆轉(zhuǎn)錄引物主要有3種,包括 OligodT)、Random Primers 和基因特異性引物(GSP)。其中 OligodT)具有12-20個(gè) T 堿基,并且與真核生物 mRNA 3Poly A 尾配對(duì),可合成全長(zhǎng)的 cDNA,但僅擴(kuò)增有 polyA 尾的 mRNA ,對(duì)模板質(zhì)量要求高,較適合克隆實(shí)驗(yàn)。而 Random Primers 具有6-9個(gè)堿基,可隨機(jī)識(shí)別模板并結(jié)合,適合復(fù)雜結(jié)構(gòu)和微量模板,但特異性低,小片段多,適合后續(xù) qPCR 實(shí)驗(yàn)?;蛱禺愋砸锟梢宰R(shí)別特定模板序列,具有特異性強(qiáng),靈敏度高的特點(diǎn),但需合成特定的序列。所以根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)需求可進(jìn)行相應(yīng)引物的選擇。

2. 逆轉(zhuǎn)錄酶:

一種是來自純化的禽成髓細(xì)胞瘤病毒(AMV),由兩條肽鏈組成,具有聚合酶活性和很強(qiáng)的 RNaseH 活性,它最適溫度是42℃,最適 pH8.3,在高反應(yīng)溫度時(shí)可消除 mRNA 的二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)逆轉(zhuǎn)錄的阻礙,然而高水平的 RNaseH 的活性既抑制 cDNA 產(chǎn)生也限制其長(zhǎng)度。另一種來源于鼠白血病病毒(M-MLV),是單肽鏈的,有 RNA 聚合酶活性和相對(duì)較弱的 RNaseH 活性,最適溫度37℃,最適 pH7.6,較弱的  RNaseH 活性對(duì)獲得2-3kbmRNA 的全長(zhǎng) cDNA 有很大好處。

3. RNA 模板:

通常利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)純度,要求A260/280=1.9~2.1,A260/230=2.0~2.2。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) RNA 的完整度,完整的總 RNA 在進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳時(shí)會(huì)產(chǎn)生清晰的28S 18S rRNA 條帶(真核樣品),28S rRNA  條帶的強(qiáng)度應(yīng)當(dāng)大致為18S rRNA 條帶的兩倍,并且無 gDNA 和蛋白殘留。

 

二、實(shí)驗(yàn)流程:

1. 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

RNA樣品、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(以諾唯贊R312為例)

2. 實(shí)驗(yàn)步驟

① 試劑化凍后,用手輕彈混勻后短暫離心。

② 基因組DNAgDNA)去除:根據(jù)RNA樣品的濃度按10pg~1μg計(jì)算用量,在RNase-free離心管中依次加入RNase-free ddH2O5×gDNA Wiper Mix 2μL,RNA樣品,總體系為10μL。用移液器吹打混勻后短暫離心。放入PCR儀,設(shè)置反應(yīng)條件為422min

③ 第一鏈cDNA合成:根據(jù)上一步反應(yīng)管的數(shù)量按以下體系在RNase-free離心管中配制預(yù)混液:RNase-free ddH2O 5μL,逆轉(zhuǎn)錄引物(2μM1μL10×RT Mix 2μL,HiScript II Enzyme Mix 2μL,用移液器吹打混勻后短暫離心。在上一步得到的反應(yīng)管中每管加入10μL,用移液器吹打混勻后短暫離心。放入PCR儀,設(shè)置反應(yīng)條件為255min5015min,855min。所得cDNA產(chǎn)物可立即用于qPCR反應(yīng)或-20℃保存。


三、注意事項(xiàng):

1. 防止RNase污染:保持實(shí)驗(yàn)區(qū)域潔凈;操作時(shí)需穿戴干凈的手套、口罩;實(shí)驗(yàn)所用的離心管、槍頭等耗材均需保證RNase-free

2. 反應(yīng)液的配制要在冰上操作完成,防止溫度過高造成RNA降解。

3. cDNA保存時(shí)避免反復(fù)凍融。


四、常見問題:

1. 逆轉(zhuǎn)錄后的產(chǎn)物可以測(cè)濃度嗎?

不建議測(cè)濃度,一般評(píng)估RNA模板的質(zhì)量,需要從濃度、純度及完整性三方面進(jìn)行考量,但逆轉(zhuǎn)錄后的產(chǎn)物是一個(gè)混合體系,有cDNA、未全逆轉(zhuǎn)錄的RNAdNTP、殘余的引物以及各種蛋白和鹽離子等成分,會(huì)干擾cDNA的吸光度,因此不建議用逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA來檢測(cè)濃度與純度。

2. 如何檢測(cè)RNA逆轉(zhuǎn)錄成功與否?

1) 內(nèi)參法:理論上,逆轉(zhuǎn)錄的cDNA是長(zhǎng)度不同的DNA片段,所以電泳條帶應(yīng)該均勻分布在泳道上,如果RNA豐度低,電泳檢測(cè)也可能無產(chǎn)物,這種情況通過PCR擴(kuò)增內(nèi)參基因,如果有擴(kuò)增產(chǎn)物,cDNA的質(zhì)量基本上可以保證(少數(shù)情況下:如目的基因片段過長(zhǎng),可能會(huì)有例外)。

2) 已知基因擴(kuò)增法:如果有已知以此模板擴(kuò)出來的基因,可以用此基因的引物驗(yàn)證。能擴(kuò)增出內(nèi)參,不一定就說明cDNA沒有問題,因?yàn)閮?nèi)參在cDNA中豐度高,容易擴(kuò)增。如果cDNA因?yàn)楦鞣N原因?qū)е虏糠纸到猓瑒t會(huì)大大影響低豐度的目的基因的PCR結(jié)果,而內(nèi)參因?yàn)槭歉哓S度基因,擴(kuò)增很可能不受影響。

3. 逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中存在gDNA對(duì)后續(xù)qPCR實(shí)驗(yàn)有何影響?

當(dāng)cDNA產(chǎn)物中混有gDNA時(shí),cDNAgDNAqPCR反應(yīng)時(shí)會(huì)被同時(shí)擴(kuò)增,無法區(qū)分熒光信號(hào)是來自于cDNA還是gDNA,因此定量結(jié)果可能會(huì)存在偏差。特別是低表達(dá)量的基因,本身的擴(kuò)增信號(hào)低,Ct值大,更加容易受到gDNA污染的影響。在逆轉(zhuǎn)錄的時(shí)候,加一步gDNA去除的步驟,能夠有效降低gDNA污染的影響,增加實(shí)驗(yàn)的可信度。

 


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