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ELISA酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定呈色反應(yīng)色彩分析
點(diǎn)擊次數(shù):281 更新時(shí)間:2024-04-22

       ELISA又稱酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定,是定量檢測(cè)體液中各種靶標(biāo)蛋白含量的常用方法。其呈色反應(yīng)可進(jìn)行定性或定量分析,利用HRP酶催化TMB,反應(yīng)產(chǎn)生藍(lán)色亞胺溶液,加入終止液后,使藍(lán)色陽(yáng)離子轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色的聯(lián)苯醌。除了常見(jiàn)的藍(lán)色和黃色,ELISA實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,也會(huì)出現(xiàn)一些不同尋常的多樣色彩。

一、墨綠色 / 深藍(lán)色

例:加入底物溶液孵育后,酶標(biāo)板孔溶液變成墨綠色或深藍(lán)色。

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在正常的ELISA實(shí)驗(yàn)中,加入底物溶液孵育后,標(biāo)曲前四孔出現(xiàn)明顯藍(lán)色梯度,即可終止反應(yīng)。但是,當(dāng)孵育的HRP酶結(jié)合物工作液濃度過(guò)高,或樣本濃度遠(yuǎn)高于檢測(cè)范圍時(shí),標(biāo)曲最高1-2個(gè)梯度孔或樣本孔可能會(huì)呈現(xiàn)墨綠色或深藍(lán)色。

墨綠色樣本終止反應(yīng)后,在450nm波長(zhǎng)下讀取的OD值可能會(huì)比實(shí)際要低;深藍(lán)色標(biāo)曲會(huì)由于梯度OD值過(guò)于接近,無(wú)法擬合得到有效標(biāo)曲并準(zhǔn)確計(jì)算樣本濃度。

建議:

(1)嚴(yán)格控制每一步的孵育溫度和時(shí)間,按照說(shuō)明書(shū)要求制備HRP酶結(jié)合物工作液;

(2)在顯色階段,通過(guò)前四孔出現(xiàn)明顯藍(lán)色梯度來(lái)控制顯色時(shí)間;

(3)濃度過(guò)高的樣本需要稀釋到試劑盒檢測(cè)范圍內(nèi),再進(jìn)行測(cè)定。

二、黃色

例:終止反應(yīng)后,整板變成黃色。

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可能原因:

1 競(jìng)爭(zhēng)法按照夾心法操作:兩者原理不同,操作步驟不同,請(qǐng)注意區(qū)分。

2 洗滌不當(dāng):甩板時(shí)離廢液桶太近,導(dǎo)致液體反濺;甩板不干脆,導(dǎo)致液體殘留或流入其他孔;洗滌時(shí)每孔注入的洗液不夠,或洗滌次數(shù)不夠;液體過(guò)多溢出污染;浸泡時(shí)間過(guò)短;

3 顯色劑保存不當(dāng),或孵育時(shí)未避光,造成非特異性顯色;

4 孵育溫度過(guò)高,或孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng);

5 不同試劑盒組分混用或替代,產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)或非特異性吸附,導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。

三、標(biāo)曲正常,樣本孔全黃

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讀值計(jì)算后,發(fā)現(xiàn)標(biāo)曲擬合效果良好,但樣本OD超過(guò)標(biāo)曲最大OD,表明樣本還需要稀釋哦。

四、 黑色

例:加入終止液后,酶標(biāo)板孔中液體變黑,或產(chǎn)生黑色沉淀。

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可能原因:

1、HRP酶濃度過(guò)高:準(zhǔn)備HRP酶工作液時(shí),保證計(jì)算和配制體積準(zhǔn)確,按照說(shuō)明書(shū)中的洗滌體積、時(shí)間、次數(shù)進(jìn)行洗板;

2、樣本中指標(biāo)濃度過(guò)高,樣本還需要稀釋;

3、終止液中硫酸濃度過(guò)高或變質(zhì):終止液是1M H2SO4,混用過(guò)高濃度的硫酸可能導(dǎo)致炭化反應(yīng)。


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